赤霉酸是五類植物之一。是存在于植物體內(nèi)的一大類四環(huán)二萜類化合物，至今已發(fā)現(xiàn)100多種，總稱赤霉素類(GAs)t1。其中只有少數(shù)赤霉酸具有生物活性．能作用于高等植物的整個(gè)生命周期。它有許多與植物生長和發(fā)育相關(guān)的生理功能。如誘導(dǎo)Ot一淀粉酶的形成、促進(jìn)禾谷類種子萌發(fā)、促進(jìn)節(jié)間和葉片伸長、促使莖的伸長和植株增高、促進(jìn)花器官形成和孤雌生殖及果實(shí)形成等。但大多數(shù)植物體內(nèi)的活性GAs以GA1或GA4為主。中間產(chǎn)物和非活性GAs(結(jié)合態(tài)GAs1有幾十種。GA類似物、GA合成抑制劑在農(nóng)作物和觀賞植物上有多種用途，已發(fā)揮重要的作用。草坪具有綠化美化、水土保持、調(diào)節(jié)小氣候、觀賞和運(yùn)動(dòng)等功能．對于居民休憩、娛樂及景觀等具有舉足輕重的作用。然而。草坪修剪與灌溉等耗費(fèi)了大量的人力和物力。常30%一40%的管理費(fèi)用于草坪草修剪。矮化的草坪草以其低修剪率、低耗水率而受到越來越多的重視。逐漸成為草坪草育種工作的一個(gè)方向。首先討論赤霉酸的植物矮化作用。其次探討赤霉酸在草坪草矮化育種中的應(yīng)用前景。
1赤霉酸的矮化作用
GA是調(diào)節(jié)和控制植物生長基本的一種內(nèi)源，與GA有關(guān)的矮化突變可分為兩類，合成型突變體和非應(yīng)答型突變體。
1．1合成型矮化突變體
合成型突變體在于抑制、阻礙了的生物合成和代謝步驟，使得內(nèi)源GA缺乏或痕量存在。合成型突變體叉分為兩類：GA缺陷型和GA失活型。絕大部分的突變體屬于GA缺陷型，呈明顯的矮化。其體內(nèi)GAs的含量顯著降低。外施GA可恢復(fù)正常型特征，。如水稻突變體d和豌豆突變體le表現(xiàn)出GA缺乏表型，呈現(xiàn)明顯畸矮、葉片深綠突變型，能抑制GAs對糊粉層中儀．淀粉酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)；d突變體的節(jié)間伸長對活性GA的敏感性較野生型植株弱100倍。現(xiàn)在已經(jīng)分離到了d基因．通過克隆和序列分析證明它編碼參于GA生物合成過程中的一個(gè)酶．GA20氧化酶(GA20ox)。GA20．氧化酶屬于可溶性個(gè)雙加氧酶，能催化GA生物合成中倒數(shù)第二步的從C∞氧化到C。．GAs結(jié)構(gòu)的形成[I3】。已從西瓜、擬南芥、水稻、菠菜、豌豆、南瓜、煙草等植物中克隆出GA20．氧化酶基因的cDNA。各種植物的GA20．氧化酶是由小的多基因家族編碼的，其氨基酸序列在不相關(guān)的物種中同源性不高，為50%一60%，而基因家庭成員有65%一85%的同源性。比較幾種植物的GA20．氧化酶氨基酸序列發(fā)現(xiàn)。它們都有一些共同的保守基元，如與結(jié)合2．酮戊二酸有關(guān)的保守一致序列NYYPX．CQKP。保守的H和D殘基、LPWKET基元(與GA底物結(jié)合有關(guān))[181。GA20．氧化酶是嚴(yán)格調(diào)控的酶，既受反饋調(diào)節(jié)。又受光周期調(diào)節(jié)。GA合成受損的擬南芥矮化突變體中積累的GA20．氧化酶比野生型的還要多。外施有活性的GA。此mRNA水平就下降。同樣情況也在豌豆中發(fā)生。很少突變屬于GA失活型。株高明顯增加，其體內(nèi)GA含量過高，外施GA合成抑制劑將顯著降低株高。Carrera等克隆了馬鈴薯的3種GA20．氧化酶基因，即StGA20oxl，StGA20ox2，StGA20ox3，馬鈴薯的gal突變體(13羥基化步驟被阻斷)積累較高的GA20．氧化酶轉(zhuǎn)錄本，外施GA3后，3種酶表達(dá)在馬鈴薯gal突變體內(nèi)大幅度減少：用GA合成抑制劑處理野生型馬鈴薯，會(huì)增加StGA20oxl和StGA20ox3的轉(zhuǎn)錄豐度，說明GA20．氧化酶是受反饋機(jī)制調(diào)節(jié)的。另外，GA的生物合成中還存在滅活機(jī)制。另一個(gè)依賴于2．酮戊二酸的雙加氧酶GA213羥基化酶(GA2．氧化酶)能使C．2位發(fā)生羥基化而滅活GAs分子，從而使活性的GAs滅活并終使代謝終止。
1．2非應(yīng)答型矮化突變體
GA非應(yīng)答型矮化突變體其突變體表現(xiàn)出GA合成缺陷型矮化，但體內(nèi)含有大量有生物活性的GAs。這似乎是矛盾的。因?yàn)榍o的伸長通常是由有活性的GA量來控制的，然而它正揭示了GA的應(yīng)答和GA的生活合成之間的關(guān)系。這些矮化突變體不能響應(yīng)GA，也不會(huì)降低GA的生物合成，說明這些基因在正常的情況下很可能參與了GA信號的接收或傳遞過程，其矮化的根本原因可能是信號傳導(dǎo)過程中斷。GA非應(yīng)答型矮化突變體又分2種亞型，即隱性GA非應(yīng)答型矮化突變體和半顯性的GA非應(yīng)答型矮化突變體，二者相應(yīng)的突變基因編碼GA．信號傳導(dǎo)的正調(diào)節(jié)因子。
1．2．1隱性GA非應(yīng)答型矮化突變體隱性GA非應(yīng)答型矮化突變體如水稻的突變體(d)、大麥的突變體(gse)、擬南芥突變體(s1、pk1)呈半畸矮表型．外源GAs處理不能恢復(fù)這些突變體莖的伸長。d和gse突變體抑制了活性GAs對糊粉層細(xì)胞中的儀．淀粉酶基因的誘導(dǎo)表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)d基因編碼異源三聚體G蛋白的儀．亞單位。復(fù)合蛋白儀．亞單位的突變導(dǎo)致信號傳導(dǎo)中斷，使GAs不能發(fā)揮正常作用，而使植物矮化。
1．2．2半顯性的GA非應(yīng)答型矮化突變體在半顯性的GA的非應(yīng)答突變體中。如小麥的R(R．和R．D)。玉米的D8和D9及擬南芥的GAI，這些容、變體內(nèi)積累了較高水平的活性GA1，說明突變體破壞了GA的信號傳導(dǎo)。而通過正反饋?zhàn)饔脕碚{(diào)節(jié)GA的生物合成．這些基因?qū)A作用不敏。Rht、D8、GAI和RGA是GRAS蛋白質(zhì)家族的成員。GRAS家族蛋白質(zhì)具有轉(zhuǎn)錄因子的功能，現(xiàn)在已有33個(gè)G成員被克隆。這個(gè)蛋白的亞組成員在N端有兩個(gè)保守區(qū)，其中包括由27個(gè)氨基酸構(gòu)成的基序，即“DELLA”保守基元，“DEUA”結(jié)構(gòu)域的缺失導(dǎo)致擬南芥、玉米的半顯性矮突變。Peng等(1999)的研究也表明因Rht．B1和Rht．D等位基因發(fā)堿基置換，而在“DELLA”區(qū)產(chǎn)生終止密碼子，而導(dǎo)致小麥的矮化突變。由此可見，Rht、D8、GAI等蛋白質(zhì)具有GA信號傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)因子的作用，這些蛋白如果在N端存在，GA則可通過抑制這些蛋白的功能而行使矮化作用。
2在草坪草育種中的應(yīng)用前景
2．1草坪草GA突變體的篩選
如前所述，與GA有關(guān)的矮化突變體有非應(yīng)答型矮化突變體和合成型矮化突變體，可以人為的大量噴施有生物活性的赤霉酸，使GA在植物體內(nèi)過量表達(dá)，以期產(chǎn)生矮化突變體。在自然界中，由于植物生存環(huán)境的變化，植物為適應(yīng)新的環(huán)境可能做出相應(yīng)的變化，有時(shí)會(huì)產(chǎn)生矮化表型，可以選育這種表型來育成矮化品種。同時(shí)我們也可以用物理化學(xué)的方法來創(chuàng)造突變體，可以用飛船搭載草坪草種子產(chǎn)生變異，也可以利用、X、p、中子、無線電微波、激光、紫外線等照射草坪草的種子、花粉、植株、培養(yǎng)組織或其他器官。使其遺傳物質(zhì)發(fā)生改變產(chǎn)生各種變異，在發(fā)生變異的個(gè)體中選擇矮化突變體培育成新品，應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。
2．2利用現(xiàn)有的矮化基因改良草坪草品種
利用基因工程手段培育和改良植物品種是一種便捷和實(shí)用的途徑。近幾年，由于國家的西部大開發(fā)戰(zhàn)略的實(shí)施以及生態(tài)環(huán)境的保護(hù)需要，培育優(yōu)質(zhì)的的草坪草品種成為研究的熱點(diǎn)問題。目前，多年生黑麥草、草地早熟禾、高羊茅、結(jié)縷草、狗牙根等草坪草的遺傳轉(zhuǎn)化體系已基本成熟，并且已成功的通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)獲得了一批具有抗性草坪草植株，但是還未見把矮化基因轉(zhuǎn)化到草坪草中的報(bào)道。20世紀(jì)以“高產(chǎn)良種、化肥，灌溉、農(nóng)藥”四大技術(shù)為動(dòng)力掀起的農(nóng)業(yè)中的“綠色革命”是農(nóng)業(yè)史上的偉大事件。而糧食作物中矮化基因的利用，在這次革命中起著重要的作用。迄今，綠色革命中所應(yīng)用的小麥和水稻半矮桿性狀基因已克隆和鑒定。這些基因都與GA的生物合成和信號傳導(dǎo)有關(guān)。基于草坪草不同于糧食作物的特殊性，我們可以利用現(xiàn)已成熟的轉(zhuǎn)基因體系把如Rht、D8、D9、GA1等矮化基因轉(zhuǎn)化到草坪草中，培育成矮化品種，從而降低修剪強(qiáng)度，以節(jié)省草坪養(yǎng)護(hù)成本。
2．3通過基因克隆技術(shù)改良現(xiàn)有的草坪草品種近年來，隨著分子生物學(xué)、分子遺傳學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、生理生化等學(xué)科的發(fā)展，已經(jīng)掌握了大量有關(guān)植物優(yōu)良性狀基因的生物學(xué)和遺傳學(xué)特性，并且這些基因已在染色體上定位。特別是進(jìn)入20世紀(jì)80年代以后，由于寡核苷酸合成技術(shù)的改良、RNA和DNA操作技術(shù)的完善、酶學(xué)方面的進(jìn)步，尤其是PCR技術(shù)的快速發(fā)展，人們分離基因技術(shù)的能力和范圍得到進(jìn)一步的提高，現(xiàn)在已經(jīng)克隆出了與植物抗病、抗逆、抗蟲、抗除草劑、育性，優(yōu)質(zhì)、及發(fā)育等相關(guān)基因。經(jīng)過20多年的發(fā)展，植物基因克隆技術(shù)已基本完善。
近幾年，幾乎所有編碼GA合成過程中的酶基因都被克隆出來了，其中豌豆、擬南芥、玉米和水稻中GA缺陷型的研究為詳盡，這幾種植物的GA生物合成基因的許多位點(diǎn)已被鑒定，而且獲得了部分與其相關(guān)的突變體。GA生物合成是受反饋抑制控制的，反饋機(jī)理主要表現(xiàn)在控制編碼GA20．氧化酶和GA3B羥基化酶兩個(gè)基因的表達(dá)水平。在許多植物GA缺乏的矮生突變體中都具有異常高水平的生物活性GA(CGA)，相反細(xì)長型突變體的生物活性GA卻相當(dāng)?shù)停?dāng)外源施入有生物活性的GA時(shí)，豌豆矮生突變體(3．B羥基化酶被損害)內(nèi)源大量存在的C曠GA大大減少，而C加．GA則增加：在南瓜中過量表達(dá)的GA．20氧化酶產(chǎn)生極度矮化的植物。而嚴(yán)遠(yuǎn)鑫等通過水稻GA20．氧化酶基因的正義和反義轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致了轉(zhuǎn)基因水稻莖桿的增高和矮化。本實(shí)驗(yàn)室利用簡并PCR技術(shù)已從結(jié)縷草中克隆到GA20．氧化酶基因，構(gòu)建了正義和反義表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)化到我國南北方廣泛應(yīng)用的冷季型草坪草高羊茅中，以期獲得矮化的高羊茅新品種。這將有可能人為地控制植物在草坪草體內(nèi)的合成。同時(shí)可以更深入地研究赤霉酸的作用機(jī)理。更重要的是篩選矮化的轉(zhuǎn)基因草坪草植株以便形成品種。從而省去外施和修剪所耗費(fèi)的人力和物力，這將具有很大的經(jīng)濟(jì)效益。