作物真菌或細菌病害是導致作物產量降低的重要因素。殺菌劑被用來防治這些病害，保持作物的產量和產品的品質。水稻是亞洲各國種植的***重要作物之一。水稻的生產仍然受到許多病原微生物的威脅，需要新穎的殺菌劑來穩定地防治這些病害。
Tolprocarb是日本三井化學農業公司開發的防治水稻稻瘟病（Magnaporthe grisea）的殺菌劑。稻瘟病對水稻生產有極大危害，此病害的病原菌已產生抗性，故對其防治是一大挑戰。
雖然有許多作用機制的殺菌劑能用于防治此病害，但一些殺菌劑防效已不佳。稻瘟病抗性菌株，例如抗呼吸鏈復合體Ⅲ——醌外位點細胞色素bc1（醌外部抑制劑：Qol）抑制劑或黑色素生物合成中脫水酶抑制劑（黑色素生物合成抑制劑——脫水酶抑制劑；MBI-Ds）菌株產生。對tolprocarb的2種作用機制進行了研究：抑制黑色素生物合成途徑中聚酮合酶（MBI-P）和誘導植物系統性抗性。由于tolprocarb具有獨特的作用機制，推測靶標真菌發展抗性的風險會低。Tolprocarb不僅對稻瘟病，而且對細菌病害有強的生物活性，對哺乳動物或環境的影響小。本文介紹了tolprocarb的合成、生物活性和作用機制。
1 合成
1.1 先導物的發現
在對卵菌綱病害殺菌劑開發的過程中，發現化合物1對水稻稻瘟病有防治作用。化合物1和纈霉威（iprovalicarb）僅在甲基的有無和羰基的位置不同。卵菌綱病原菌殺菌劑纈霉威對稻瘟病沒有活性。有趣的是化合物1對卵菌綱植物病原菌如使馬鈴薯和番茄發生枯萎病的晚疫病菌（Phytophthora infestans）沒有活性。纈霉威結構的小小改變，其殺菌活性譜發生很大變化，化合物1的作用機制不同于纈霉威。
在馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上，稻瘟病菌菌絲由于形成黑色素而變黑，而用化合物1處理后，菌絲的延長沒有被抑制，而顏色變白。化合物1處理的菌絲的顏色不同于用傳統MBI處理的，這表明用化合物1和MBI處理后，積累的中間物不同。此外，研究表明化合物1和MBI-D沒有交互抗性。這些結果表明化合物1作用于黑色素生物合成途徑中新的靶標位點。因此以化合物1為先導物，對其進行結構修飾。
1.2 先導化合物的優化和構效關系
先導化合物1的結構被分成3個部分：A－C，對每部分結構進行優化，對其構效關系進行了總結。
基團A中的氨基甲酸酯或硫代氨基甲酸酯鍵比酰胺或脲鍵有更高的活性。在A基團端的異丙基被2，2，2-三氟乙基取代后化合物活性增加。甲基氨基甲酸酯衍生物比異丙基氨基甲酸酯衍生物的活性低。基團B中的S-對映異構體比R-對映異構體的活性高。三氟甲基衍生物和異丙基衍生物的活性水平相同。正丙基衍生物的活性低于異丙基衍生物。疏水異丁基和親水的甲基磺酰甲基（methylsulfanyl methyl group）的引入會降低化合物的活性。
基團C中，引入對甲基比引入鄰甲基或間甲基活性高。在對位引入氯原子比引入甲基的活性低。未取代化合物比2-和3-甲基類似物活性高，但比4-甲基和4-氯類似物的活性低。C環4-位的取代好像能提高活性。
***后，在考慮各種因素后，例如在田間試驗的長殘留活性，選擇tolprocar來開發。
2 合成
以N-叔丁氧基羰基-（N-Boc-）保護的L-纈氨酸甲酯（a）合成tolprocarb。首先與硼氫化鈉發生還原反應，之后發生Mitsunobu偶聯反應，再肼解生成胺衍生物（d）。之后形成酰胺鍵，再去N-Boc保護后得到胺衍生物（f）。***后胺衍生物（f）和氯甲酸酯（g）發生反應生成tolprocarb。
3 抑制菌絲的生物合成
3.1 作用機制
在1965年，三共株式會社（現在稱為三井化學農業公司）開發了MBI和2，3，4，5，6-五氯苯甲醇。在20世紀70年代研究了黑色素生物合成的還原酶抑制劑（黑色素生物合成還原酶抑制劑；MBI-Rs），在20世紀90年代研究了MBI-Ds。已知淺藍菌素為黑色素生物合成過程中的聚酮合酶（PKS）抑制劑，但在tolprocarb進入市場、實際應用之前，沒有能抑制PKS的其他化合物，tolprocarb是一款實踐意義上抑制PKS的殺菌劑。
在tolprocarb開發的早期，就發現在含有tolprocarb的瓊脂培養基上培養稻瘟病菌菌落時，稻瘟病菌的著色受到了抑制。與用含有傳統的MBI，例如MBI-R或MBI-D的瓊脂培養基培養的菌落相比，含有tolprocarb的培養基培養的菌落著色少。進行了恢復試驗來評估了tolprocarb的作用機制。用含有黑色素中間體和tolprocarb的瓊脂培養稻瘟病菌來測定絲狀菌落的顏色。在含有tolprocarb瓊脂培養基上的顏色淺的菌落再在含有1，3，6，8-四羥基萘（1，3，6，8-THN）的培養上培養，菌落的顏色恢復正常。因此，推測tolprocarb通過抑制調節聚酮合酶和酮內酯（pentaketide）環化的1，3，6，8-THN上游的聚酮合酶活性而抑制菌落的著色。這通過測定含有稻瘟病菌的PKS基因的轉基因米曲霉（Aspergillus oryzae）中1，3，6，8-THN積累的量來測定。與一些傳統的MBI相比，只有tolprocarb抑制離體PKS的活性。這些結果表明tolprocarb作用于稻瘟病菌PKS，這不同于其他傳統的MBI。由于此作用機制，殺菌劑抗性行動委員會（FRAC）把tolprocarb分為MBI-PKS（MBI-P）類別。
3.2 對稻瘟病菌生命周期的影響
MBI-D和MBI-R等傳統MBI對稻瘟病菌生命周期的影響已被確定。這些殺菌劑抑制稻瘟病菌附著胞的黑化作用，阻礙分生孢子從分生孢子梗分散。也發現了tolprocar對這些細胞和孢子的作用。***可能的是，MBI-D/MBI-R和tolprocarb抑制稻瘟病菌附著胞的黑化，阻礙分生孢子的分散。暴露于tolprocarb的脫色分生孢子比有色分生孢子對陽光（紫外線光）更敏感。用tolprocar處理后的脫色分生孢子的發芽率要低于用MBI-D或MBI-R殺菌劑處理的，甚至在多云或雨天（紫外線強度：500～2 000 μW/cm2）。用投射電子顯微鏡法（TEM）發現附著胞或分生孢子的黑化作用被抑制。稻瘟病菌附著胞的黑化對侵染釘產生膨壓，滲透進入寄主細胞重要。相比之下，對分生孢子中黑色素功能研究不多。如前所述，MBI抑制分生孢子從分生孢子梗分散，但具體機制未知。然而，黑化作用與分生孢子從分生孢子梗分散的能力有關。
4 系統性獲得抗性（SAR）
4.1 擬南芥系統性獲得抗性
SAR是植物體的非特異性系統性免疫響應，由信號化合物水楊酸（SA）誘導產生。NPR1和WRKY45調節SA信號傳導途徑中的不同病程相關基因，例如PR-1、PR-2、PR-5和PBZ1，這些基因編碼葡聚糖酶和幾丁質酶等PR蛋白，還調節植物抗毒素合成途徑。
測定含有煙草PR-1a啟動子-Fluc（熒光素酶）報告基因框架（PR-1a:Fluc）的轉基因擬南芥的研究表明tloprocarb能誘導擬南芥產生系統獲得性抗性。在擬南芥的2個生長階段：剛發芽和3周齡大的植株中發現了PR-1a啟動子的活性。在處理擬南芥苗后96 h，檢測到擬南芥苗中PR-1a啟動子活性；灌溉處理成熟植株后96、120 h檢測到植物體內PR-1a啟動子的活性。用tolprocarb處理成熟擬南芥葉片，10 d后接種十字花科黑斑病菌（Pseudomonas syringae pv. maculicola，Psm），評估tolprocarb對此病菌的防治潛力。接種3 d后，Psm侵染量降低。結果表明tolprocarb處理能誘導SAR活性。
4.2 水稻SAR活性
已確定tolprocarb是擬南芥SAR活性的強誘導劑，因此評估了tolprocarb是否能誘導水稻產生SAR活性。用定量逆轉錄聚合酶鏈反應發現用tolprocarb處理后水稻中PR基因的活性。在處理后24 h或72 h，tolprocarb促進SA-介導的信號傳導途徑相關基因的表達，例如PBZ、β-1，3-葡聚糖酶和幾丁質酶1。相反，其不促進茉莉酮酸-（JA-）-介導的信號傳導途徑有關的基因表達。這些表明tolprocarb通過加速SA信號傳導途徑而誘導SAR活性。
已知SA和JA為誘導植物產生免疫力的信號傳導化合物。特別是，SA信號傳導途徑與保護植物免受病原真菌或細菌危害的功能有關。因此，預期tolprocarb具有防治水稻細菌病害的潛力，發現具有防治水稻白葉枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae）的活性。
Tolprocarb能阻止水稻葉上病害癥狀的擴展。tolprocarb主要通過MBI-P活性而對稻瘟病有效，但不清楚是否第2種作用機制——SAR活性也在其中起作用，且一直難以發現是MBI-P還是SAR所致活性。Hiroyuki Hagiwara等人應用黑色素中間體的2個恢復試驗來區分它們。首先，在用黑色素中間體1，8-二羥基萘處理的水稻葉上接種稻瘟病菌，培養。再在表面交聯（SCL）的瓊脂培養基上接種稻瘟病菌，培養，通過人工培養基上的附著胞來觀察稻瘟病菌的侵染。在第1個試驗中，tolprocarb處理阻止了水稻細胞上的黑色素恢復的稻瘟病菌的附著胞滲透入水稻。而后tolprocarb處理后沒有抑制SCL培養基上的病原菌的滲透。這兩個結果表明活體植物細胞對tolprocarb處理后阻止黑色素恢復的稻瘟病菌侵染必要。因此，這表明tolprocarb通過2種作用機制抑制稻瘟病菌的侵染：MBI活性和誘導寄主的防御響應。
5 對稻瘟病的活性
5.1 在田間對稻穗頸瘟的活性
含有9%或4% tolprocarb的顆粒劑是內吸性殺菌劑，用于育苗箱中植物的根部，含有3% tolprocarb的顆粒劑施于水稻田水中。Tolprocarb對葉瘟和穗頸瘟有強的防治活性，尤其對穗頸瘟的防效特別高。用約束極大似然法進行的meta分析和2007－2015年用9%或4% tolprocarb顆粒劑處理的育苗箱的田間試驗防效數據證實了此特性。3%顆粒劑用于水稻田水處理的數據統計分析表明在水稻抽穗前5～29 d處理對穗頸瘟有優異的防效。
Tolprocarb在各種類型土壤中都穩定；在36種類型土壤中吸附較小，包括日本的25種火山土，土中的有機碳含量、陽離子的交換能力、磷酸的吸收能力和pH等這些因素都對吸附沒有影響。試驗土壤的吸附率為7%～42%，而20%～100%吸附的tolprocarb能被水解吸。
5.2 對抗性菌株的活性
水稻病害抗性菌株的出現影響了水稻的生產，是水稻種植中一大問題。在日本，抗MBI-D或QOl菌株的出現成為水稻生產中的難題。tolprocarb對抗MBI-D或Qol菌株有穩定的防治作用，將會是實際應用中防治水稻真菌病原菌很好的選擇。
6 總結
Tolprocarb是從iprovalicarb類似物的衍現的，但其作用機制完全不同于MBI-P。Tolprocarb也能誘導擬南芥和水稻產生SAR，通過誘導SAR活性而對細菌病害和稻瘟病有很強的活性。由于這兩個作用機制和防效高，抗性不易產生。在水稻田，tolprocarb顆粒劑對稻瘟病有高的防效，對穗頸瘟有的防效，包括對MBI-D或Qol殺菌劑有抗性的菌株。根據這些特點，tolprocarb對不僅稻瘟病而且細菌病害的水稻病害有穩定的強的防效。tolprocarb用于作物生產將會有很好的前景。
來源： 世界農藥